一、摘要

禾谷類(lèi)作物外源基因?qū)肱c表達(dá)的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展。詳細(xì)闡述了常用的外源基因?qū)敕椒ǎㄞr(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法等，以及影響外源基因在禾谷類(lèi)作物中表達(dá)的多種因素，如啟動(dòng)子選擇、基因沉默現(xiàn)象等。此外，對(duì)目前研究成果在提高作物產(chǎn)量、增強(qiáng)抗逆性等方面的應(yīng)用進(jìn)行了討論，并對(duì)未來(lái)研究方向提出展望，旨在為禾谷類(lèi)作物基因工程改良提供全面而深入的參考。

二、引言

禾谷類(lèi)作物是全球重要的糧食作物，為人類(lèi)提供了大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著人口增長(zhǎng)和環(huán)境變化，提高禾谷類(lèi)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性成為保障全球糧食安全的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的育種方法在一定程度上滿足了人類(lèi)對(duì)禾谷類(lèi)作物改良的需求，但存在周期長(zhǎng)、遺傳資源有限等局限性。基因工程技術(shù)的出現(xiàn)為禾谷類(lèi)作物的改良提供了新的途徑，通過(guò)將外源基因?qū)牒坦阮?lèi)作物，可以賦予其新的優(yōu)良性狀，如抗病蟲(chóng)害、抗逆、提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等。因此，深入研究禾谷類(lèi)作物外源基因?qū)肱c表達(dá)對(duì)于推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。

三、外源基因?qū)牒坦阮?lèi)作物的方法

（一）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

原理

農(nóng)桿菌是一種天然的基因工程載體，其中根癌農(nóng)桿菌含有 Ti 質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌含有 Ri 質(zhì)粒。當(dāng)農(nóng)桿菌感染植物傷口時(shí)，Ti 或 Ri 質(zhì)粒上的 T - DNA 區(qū)可以轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中。在基因工程應(yīng)用中，將目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的 T - DNA 區(qū)域，通過(guò)農(nóng)桿菌與禾谷類(lèi)作物組織的共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入。

實(shí)驗(yàn)步驟

農(nóng)桿菌菌株的選擇與培養(yǎng)：選擇適合禾谷類(lèi)作物轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株，如 LBA4404 等。將農(nóng)桿菌接種于含有相應(yīng)抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 28℃、200rpm 的條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

禾谷類(lèi)作物外植體的準(zhǔn)備：選取合適的禾谷類(lèi)作物組織作為外植體，如水稻的幼胚、玉米的幼穗等。將外植體消毒后，在無(wú)菌條件下切成適當(dāng)大小。

共培養(yǎng)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌菌液與外植體在共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)基中通常含有特定的植物激素和乙酰丁香酮等誘導(dǎo)物質(zhì)。共培養(yǎng)條件一般為 22 - 25℃、黑暗環(huán)境下培養(yǎng) 2 - 3 天。

篩選與再生：共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移至含有篩選抗生素的再生培養(yǎng)基上，抑制未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生。經(jīng)過(guò)多次篩選和繼代培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

（二）基因槍法

原理

基因槍法又稱(chēng)微彈轟擊法，是利用高速飛行的金屬微粒（如金粉或鎢粉）將外源 DNA 帶入植物細(xì)胞。這些金屬微粒表面吸附有目的基因，在高壓氣體或爆炸等動(dòng)力作用下，微粒高速穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)步驟

微彈制備：將金粉或鎢粉與外源 DNA、氯化鈣、亞精胺等混合，使 DNA 吸附在微彈表面。經(jīng)過(guò)離心、洗滌等步驟，制備成可用于轟擊的微彈。

植物材料準(zhǔn)備：選擇禾谷類(lèi)作物的幼嫩組織或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物作為轟擊對(duì)象。將植物材料置于培養(yǎng)皿中，固定在基因槍的轟擊室內(nèi)。

轟擊參數(shù)設(shè)置：根據(jù)不同的基因槍類(lèi)型和植物材料，設(shè)置合適的轟擊壓力、距離和次數(shù)等參數(shù)。例如，對(duì)于水稻幼胚，轟擊壓力可設(shè)置為 1100 - 1300psi，轟擊距離為 6 - 9cm，轟擊次數(shù)為 1 - 2 次。

轟擊后處理：轟擊完成后，將植物材料轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，方法類(lèi)似于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中的再生和篩選步驟。

（三）其他方法

花粉管通道法

在授粉后一定時(shí)間內(nèi)，將含有外源基因的溶液注射到花柱內(nèi)，使外源基因隨著花粉管的伸長(zhǎng)進(jìn)入胚囊，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化。這種方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率較低且可重復(fù)性較差。

電穿孔法

利用高壓電脈沖在植物細(xì)胞膜上形成短暫的可逆性小孔，使外源 DNA 能夠通過(guò)這些小孔進(jìn)入細(xì)胞。該方法需要特定的電穿孔設(shè)備，并且對(duì)細(xì)胞的損傷和處理?xiàng)l件要求較為嚴(yán)格。

四、影響外源基因在禾谷類(lèi)作物中表達(dá)的因素

（一）啟動(dòng)子的選擇

啟動(dòng)子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵元件。在禾谷類(lèi)作物基因工程中，常用的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

組成型啟動(dòng)子

如 CaMV35S 啟動(dòng)子，它可以在植物的各個(gè)組織和發(fā)育階段持續(xù)驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。但在某些情況下，組成型表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育異常或能量浪費(fèi)。

組織特異性啟動(dòng)子

例如，水稻谷蛋白基因啟動(dòng)子可以在水稻種子中特異性啟動(dòng)基因表達(dá)，將目的基因在特定組織中表達(dá)可以更有效地發(fā)揮其功能，同時(shí)減少對(duì)其他組織的不良影響。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

如受干旱、高溫等環(huán)境因素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，當(dāng)植物受到相應(yīng)脅迫時(shí)，啟動(dòng)子被激活，使目的基因表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗逆性。

（二）基因沉默現(xiàn)象

基因沉默是外源基因在植物中表達(dá)過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題，主要包括轉(zhuǎn)錄水平基因沉默和轉(zhuǎn)錄后基因沉默。

轉(zhuǎn)錄水平基因沉默

主要是由于 DNA 甲基化、異染色質(zhì)化等原因，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。例如，當(dāng)外源基因插入到基因組中的某些甲基化敏感區(qū)域時(shí)，可能會(huì)發(fā)生高度甲基化，從而使基因無(wú)法正常轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄后基因沉默

與小 RNA 介導(dǎo)的 RNA 降解機(jī)制有關(guān)。當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 與細(xì)胞內(nèi)的小 RNA 互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，mRNA 會(huì)被降解，導(dǎo)致基因表達(dá)量降低或無(wú)法表達(dá)。

（三）拷貝數(shù)與整合位點(diǎn)

外源基因在禾谷類(lèi)作物基因組中的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)對(duì)其表達(dá)有顯著影響。高拷貝數(shù)的外源基因可能會(huì)引起基因沉默，而整合到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的外源基因通常比整合到沉默區(qū)域的基因表達(dá)效率更高。

五、外源基因?qū)肱c表達(dá)在禾谷類(lèi)作物改良中的應(yīng)用

（一）提高作物產(chǎn)量

通過(guò)導(dǎo)入與光合作用、養(yǎng)分吸收和利用等相關(guān)的外源基因，可以提高禾谷類(lèi)作物的產(chǎn)量。例如，將編碼高效光合作用相關(guān)酶的基因?qū)胨局校鰪?qiáng)水稻的光合效率，從而增加產(chǎn)量。

（二）增強(qiáng)抗逆性

抗病蟲(chóng)害

導(dǎo)入抗蟲(chóng)基因（如 Bt 基因）或抗病基因，可以使禾谷類(lèi)作物對(duì)害蟲(chóng)和病原菌具有更強(qiáng)的抵抗力。例如，轉(zhuǎn) Bt 基因的玉米能夠有效抵抗玉米螟的侵害。

抗非生物脅迫

引入抗逆相關(guān)基因，如抗干旱、抗鹽堿基因等。如將來(lái)自于某些耐鹽植物的基因?qū)胄←溨校岣咝←湹哪望}性，使其能夠在鹽堿地等惡劣環(huán)境下生長(zhǎng)。

（三）改善作物品質(zhì)

營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

可以通過(guò)導(dǎo)入編碼特定營(yíng)養(yǎng)成分（如維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸等）合成相關(guān)的基因，改善禾谷類(lèi)作物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。例如，通過(guò)基因工程提高水稻中維生素 A 前體的含量，有助于緩解維生素 A 缺乏問(wèn)題。

加工品質(zhì)

改變禾谷類(lèi)作物的淀粉、蛋白質(zhì)等成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以滿足不同的加工需求。如改變小麥面筋蛋白的組成，提高面粉的加工品質(zhì)。

六、研究進(jìn)展與挑戰(zhàn)

（一）研究進(jìn)展

近年來(lái)，禾谷類(lèi)作物外源基因?qū)肱c表達(dá)研究取得了顯著成果。在轉(zhuǎn)化方法上，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法不斷優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率有所提高，并且新的轉(zhuǎn)化方法也在不斷探索。在基因表達(dá)調(diào)控方面，對(duì)啟動(dòng)子的研究更加深入，能夠更精準(zhǔn)地控制外源基因的表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)多基因轉(zhuǎn)化等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)禾谷類(lèi)作物多個(gè)性狀的同時(shí)改良。

（二）挑戰(zhàn)

盡管取得了進(jìn)展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，基因沉默問(wèn)題仍然是影響外源基因穩(wěn)定表達(dá)的重要因素，需要進(jìn)一步深入研究其機(jī)制并尋找有效的解決方法。其次，對(duì)于外源基因?qū)肟赡軒?lái)的環(huán)境和食品安全問(wèn)題需要進(jìn)行更全面的評(píng)估。此外，提高轉(zhuǎn)化效率、降低成本以及拓展可轉(zhuǎn)化的禾谷類(lèi)作物品種范圍等也是未來(lái)研究需要解決的問(wèn)題。

七、結(jié)論與展望

禾谷類(lèi)作物外源基因?qū)肱c表達(dá)研究為作物改良提供了強(qiáng)大的工具和廣闊的前景。通過(guò)不斷優(yōu)化導(dǎo)入方法、深入研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及解決相關(guān)的挑戰(zhàn)，可以更有效地利用基因工程技術(shù)提高禾谷類(lèi)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性。未來(lái)的研究需要跨學(xué)科的合作，綜合考慮科學(xué)、環(huán)境和社會(huì)等多方面因素，以實(shí)現(xiàn)禾谷類(lèi)作物基因工程改良的可持續(xù)發(fā)展，為保障全球糧食安全做出更大的貢獻(xiàn)。同時(shí)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，如基因編輯技術(shù)的興起，有望與外源基因?qū)爰夹g(shù)相結(jié)合，開(kāi)創(chuàng)禾谷類(lèi)作物改良的新局面。