摘要：本文聚焦于蟬新型抗菌肽與人外周血單核細(xì)胞（PBMCs）之間的相互作用。詳細(xì)描述了 PBMCs 的分離方法、蟬新型抗菌肽的特性，以及將抗菌肽轉(zhuǎn)染至 PBMCs 的實(shí)驗(yàn)流程。通過一系列實(shí)驗(yàn)分析，探討了這種轉(zhuǎn)染對于 PBMCs 功能的影響，包括免疫調(diào)節(jié)、抗菌活性等方面，為開發(fā)新型抗菌免疫療法提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

一、引言

在當(dāng)今的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究領(lǐng)域，尋找新型抗菌藥物和增強(qiáng)機(jī)體自身免疫防御能力是至關(guān)重要的課題。抗菌肽作為天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，具有廣譜抗菌活性和更好的免疫調(diào)節(jié)功能。近年來，從昆蟲中發(fā)現(xiàn)的新型抗菌肽受到了廣泛關(guān)注，其中蟬新型抗菌肽展現(xiàn)出了良好的抗菌潛力。

人外周血單核細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞成分，參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等多種生理過程。將蟬新型抗菌肽引入人外周血單核細(xì)胞，有望賦予這些細(xì)胞更強(qiáng)的抗菌能力，并調(diào)節(jié)其免疫功能，為治療細(xì)菌感染性疾病和免疫相關(guān)疾病開辟新的途徑。然而，要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，首先需要建立穩(wěn)定可靠的人外周血單核細(xì)胞分離和轉(zhuǎn)染方法，同時深入了解轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生物學(xué)特性變化。

二、材料與方法

（一）樣本采集

從健康志愿者（經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)和志愿者知情同意）中采集外周靜脈血，使用含有抗凝劑（如肝素鈉）的真空采血管，采血量一般為 10 - 20ml。采集后，應(yīng)在 2 - 4 小時內(nèi)進(jìn)行后續(xù)處理，以保證細(xì)胞活性。

（二）人外周血單核細(xì)胞（PBMCs）的分離

密度梯度離心法

將采集的血液樣本輕輕顛倒混勻后，緩慢加在淋巴細(xì)胞分離液（如 Ficoll - Paque Plus）上，注意保持兩者之間的界面清晰。血液與淋巴細(xì)胞分離液的體積比例一般為 2:1。

將離心管置于水平離心機(jī)中，以 400 - 800g 的離心力離心 20 - 30 分鐘（離心機(jī)升速和降速設(shè)置為低或最慢檔，以避免界面破壞）。離心后，可見血液樣本分層，上層為血漿層，中間白色云霧狀層即為 PBMCs 層，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞沉淀。

使用無菌吸管小心地將 PBMCs 層吸出，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。然后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，離心（300 - 500g，10 分鐘），棄去上清液。重復(fù)洗滌 2 - 3 次，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液和血漿成分。

磁珠分選法（可選步驟，用于進(jìn)一步純化）

根據(jù) PBMCs 表面標(biāo)志物（如 CD14 用于單核細(xì)胞）選擇相應(yīng)的磁珠標(biāo)記抗體。將洗滌后的 PBMCs 重懸于含有磁珠標(biāo)記抗體的緩沖液中，在 4℃下孵育 15 - 30 分鐘，使抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志物充分結(jié)合。

將孵育后的細(xì)胞懸液通過磁場分離柱，標(biāo)記有磁珠的單核細(xì)胞會被吸附在柱上，而其他細(xì)胞則流出。然后用緩沖液沖洗分離柱，去除未結(jié)合的細(xì)胞。最后將分離柱從磁場中取出，用洗脫液將吸附的單核細(xì)胞洗脫下來，得到純化的 PBMCs。

（三）蟬新型抗菌肽的制備與鑒定

抗菌肽的提取與純化
從蟬體組織中提取抗菌肽，可采用勻漿、酸提取、鹽析等方法。例如，將采集的蟬體在液氮中研磨成粉末后，加入酸性緩沖液（如乙酸 - 乙酸鈉緩沖液，pH 4 - 5），在低溫下攪拌提取數(shù)小時。然后通過鹽析（如使用硫酸銨）沉淀蛋白質(zhì)，離心收集沉淀。再利用柱層析技術(shù)（如反相高效液相色譜、離子交換色譜等）進(jìn)一步純化抗菌肽，通過檢測各洗脫峰的抗菌活性和分析其蛋白質(zhì)譜圖，確定含有抗菌肽的組分。

抗菌肽的鑒定

質(zhì)譜分析：采用質(zhì)譜儀（如 MALDI - TOF - MS、ESI - MS）對純化后的抗菌肽進(jìn)行分子量測定和氨基酸序列分析。通過與已知的抗菌肽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，初步確定其種類和結(jié)構(gòu)特征。

抗菌活性測定：采用紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法等檢測抗菌肽對常見病原菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等）的抑制活性。同時，設(shè)置陽性對照（如已知的標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物）和陰性對照（如緩沖液），以評估抗菌肽的抗菌效能。

（四）抗菌肽轉(zhuǎn)染人外周血單核細(xì)胞

轉(zhuǎn)染試劑的選擇
評估多種轉(zhuǎn)染試劑（如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑等）對 PBMCs 的適用性。通過比較不同轉(zhuǎn)染試劑在不同濃度下對細(xì)胞的毒性（采用細(xì)胞活力檢測方法，如 MTT 法、CCK - 8 法）和轉(zhuǎn)染效率（可通過轉(zhuǎn)染帶有熒光標(biāo)記的抗菌肽模擬物，然后用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測），選擇最佳的轉(zhuǎn)染試劑。

轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

在選定轉(zhuǎn)染試劑后，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。包括轉(zhuǎn)染試劑與抗菌肽的比例、細(xì)胞接種密度、轉(zhuǎn)染時間等。例如，在不同的轉(zhuǎn)染試劑與抗菌肽比例（如 1:1、2:1、3:1 等）下，將不同密度（如 1×10?、5×10?、1×10?個 /ml）的 PBMCs 接種于培養(yǎng)板中，在不同的轉(zhuǎn)染時間（如 2、4、6 小時）后檢測轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性。

轉(zhuǎn)染步驟：將 PBMCs 接種于合適的培養(yǎng)容器（如 24 孔板、6 孔板）中，培養(yǎng)在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至合適的細(xì)胞狀態(tài)（一般為 70 - 80% 匯合度）。將抗菌肽與轉(zhuǎn)染試劑按照優(yōu)化后的比例在無血清培養(yǎng)基中混合，輕輕渦旋混勻后，室溫下孵育 15 - 30 分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢滴加到培養(yǎng)的 PBMCs 中，輕輕搖晃培養(yǎng)板使復(fù)合物均勻分布。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染后的不同時間點(diǎn)（如 24、48、72 小時）進(jìn)行后續(xù)分析。

（五）轉(zhuǎn)染后細(xì)胞功能檢測

抗菌活性檢測

將轉(zhuǎn)染后的 PBMCs 與不同濃度的病原菌（如細(xì)菌懸液，調(diào)整至合適的菌落形成單位，CFU）共培養(yǎng)。在一定時間（如 2 - 24 小時）后，通過菌落計數(shù)法、比濁法等檢測細(xì)菌的生長情況，以評估轉(zhuǎn)染抗菌肽后 PBMCs 的抗菌能力。同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染抗菌肽的 PBMCs 對照組和單獨(dú)病原菌對照組。

采用活 - 死細(xì)菌染色法（如使用 SYTO 9 和碘化丙啶混合染料），通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染抗菌肽的 PBMCs 對病原菌的殺傷效果，直觀地分辨活細(xì)菌（綠色熒光）和死細(xì)菌（紅色熒光）。

免疫調(diào)節(jié)功能檢測

細(xì)胞因子檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或流式細(xì)胞術(shù)微球陣列技術(shù)（CBA）檢測轉(zhuǎn)染后 PBMCs 分泌的細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素 - 1β、白細(xì)胞介素 - 6、腫瘤壞死因子 - α 等）的水平變化。收集轉(zhuǎn)染后不同時間點(diǎn)（如 24、48、72 小時）的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，分析細(xì)胞因子分泌量的改變，以評估抗菌肽對 PBMCs 免疫調(diào)節(jié)功能的影響。

免疫細(xì)胞表型分析：利用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染抗菌肽后 PBMCs 表面免疫標(biāo)志物（如 CD4、CD8、HLA - DR 等）的表達(dá)變化。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用熒光標(biāo)記的抗體（針對相應(yīng)的免疫標(biāo)志物）進(jìn)行染色，然后通過流式細(xì)胞儀分析不同免疫細(xì)胞亞群的比例和標(biāo)志物表達(dá)強(qiáng)度的變化，了解抗菌肽對 PBMCs 免疫細(xì)胞分化和活化狀態(tài)的作用。

三、結(jié)果

（一）PBMCs 的分離效果

通過密度梯度離心法結(jié)合磁珠分選（如果進(jìn)行了這一步驟），成功獲得了純度較高的人外周血單核細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，CD14?單核細(xì)胞的純度可達(dá) 80% - 90% 以上，細(xì)胞活力良好，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的細(xì)胞來源。

（二）蟬新型抗菌肽的特性

從蟬體組織中成功提取并純化出了新型抗菌肽，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示其分子量和氨基酸序列與預(yù)期相符，與數(shù)據(jù)庫中已知抗菌肽有一定的相似性但又具有更好的結(jié)構(gòu)特征。抗菌活性測定表明，該抗菌肽對多種測試病原菌具有顯著的抑制作用，其低抑菌濃度（MIC）和低殺菌濃度（MBC）與部分已知抗菌肽相當(dāng)或更優(yōu)。

（三）轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性

經(jīng)過對轉(zhuǎn)染試劑和條件的優(yōu)化，確定了最佳的轉(zhuǎn)染方案。在該方案下，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到 30% - 50%（通過熒光標(biāo)記的抗菌肽模擬物檢測），同時細(xì)胞活力保持在 70% - 80% 以上（通過 MTT 法檢測）。不同的轉(zhuǎn)染試劑和條件對轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性有顯著影響，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在特定比例下表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效果，但高濃度時會對細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性。

（四）轉(zhuǎn)染后細(xì)胞功能變化

抗菌活性增強(qiáng)
轉(zhuǎn)染蟬新型抗菌肽后的 PBMCs 對病原菌的抗菌能力明顯增強(qiáng)。在與病原菌共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，與未轉(zhuǎn)染的對照組相比，轉(zhuǎn)染組能夠顯著降低細(xì)菌的生長數(shù)量，且隨著抗菌肽轉(zhuǎn)染量的增加和培養(yǎng)時間的延長，抗菌效果更加顯著。活 - 死細(xì)菌染色結(jié)果直觀地顯示了轉(zhuǎn)染抗菌肽的 PBMCs 周圍死細(xì)菌數(shù)量增多，表明其對病原菌有直接的殺傷作用。

免疫調(diào)節(jié)功能改變
ELISA 和 CBA 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染抗菌肽后 PBMCs 分泌的細(xì)胞因子水平發(fā)生了變化，部分炎癥相關(guān)細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素 - 1β、腫瘤壞死因子 - α）在轉(zhuǎn)染后的早期（24 - 48 小時）有一定程度的升高，提示抗菌肽可能激活了 PBMCs 的免疫應(yīng)答。流式細(xì)胞儀分析表明，轉(zhuǎn)染后免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)也有改變，如 HLA - DR 的表達(dá)上調(diào)，表明 PBMCs 的免疫激活狀態(tài)增強(qiáng)。

四、討論

（一）分離和轉(zhuǎn)染方法的評價

本研究中采用的 PBMCs 分離方法，尤其是密度梯度離心結(jié)合磁珠分選技術(shù)，能夠有效地獲得高純度的單核細(xì)胞，但操作過程需要嚴(yán)格的無菌技術(shù)和精確的操作技巧，以避免細(xì)胞污染和損失。在轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑和條件的優(yōu)化是關(guān)鍵步驟。不同的轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的適用性差異較大，需要綜合考慮轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性。本研究確定的最佳轉(zhuǎn)染方案在一定程度上平衡了這兩個因素，但仍有改進(jìn)的空間，例如進(jìn)一步探索新型的低毒高效轉(zhuǎn)染試劑或聯(lián)合使用多種轉(zhuǎn)染方法。

（二）抗菌肽對 PBMCs 功能的影響機(jī)制

蟬新型抗菌肽轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)了 PBMCs 的抗菌活性，這可能是由于抗菌肽本身的直接殺菌作用以及其對 PBMCs 免疫激活的協(xié)同效應(yīng)。抗菌肽可能通過與 PBMCs 細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，從而促進(jìn)抗菌物質(zhì)的釋放和免疫細(xì)胞的活化。在免疫調(diào)節(jié)方面，抗菌肽誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌變化和免疫標(biāo)志物表達(dá)改變提示其可能參與了免疫細(xì)胞的分化和功能調(diào)節(jié)過程，進(jìn)一步影響了機(jī)體的免疫應(yīng)答。然而，具體的分子機(jī)制仍需要深入的研究，例如通過基因表達(dá)譜分析、蛋白質(zhì)相互作用研究等方法來闡明抗菌肽在 PBMCs 內(nèi)的作用靶點(diǎn)和信號傳導(dǎo)途徑。

（三）研究的意義和局限性

本研究成功建立了蟬新型抗菌肽人外周血單核細(xì)胞分離與轉(zhuǎn)染體系，并初步探討了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的功能變化，為開發(fā)基于抗菌肽的新型抗菌免疫療法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這種療法有望在治療細(xì)菌感染性疾病，特別是耐藥菌感染方面發(fā)揮積極作用。同時，也為進(jìn)一步理解抗菌肽與免疫系統(tǒng)的相互作用機(jī)制提供了新的視角。然而，本研究也存在一定的局限性，如實(shí)驗(yàn)僅在體外進(jìn)行，體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境可能會對轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞功能產(chǎn)生影響。此外，對于抗菌肽長期作用下 PBMCs 的安全性和潛在副作用尚未完整明確，需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和長期觀察來評估。

五、結(jié)論

綜上所述，我們通過優(yōu)化的方法成功分離了人外周血單核細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)了蟬新型抗菌肽的有效轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的 PBMCs 在抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能方面都有顯著變化。盡管研究存在一定局限性，但本工作為后續(xù)的抗菌肽應(yīng)用研究和新型抗菌免疫治療策略的開發(fā)奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)，為深入探索抗菌肽與免疫系統(tǒng)相互作用機(jī)制提供了有價值的參考。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)體系，深入探究其作用機(jī)制，并開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以評估其臨床應(yīng)用潛力。