一、引言

多囊腎病作為一種復(fù)雜的遺傳性腎臟疾病，以雙側(cè)腎臟出現(xiàn)多個囊腫為主要特征，囊腫進(jìn)行性增大，逐漸破壞腎臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。目前，PKD 的發(fā)病機制尚未完整闡明，這給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。囊腫襯里上皮細(xì)胞作為囊腫形成和擴張的關(guān)鍵參與者，其異常的增殖、分泌和細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在疾病進(jìn)程中發(fā)揮核心作用。研究這些細(xì)胞對于揭示 PKD 的奧秘至關(guān)重要，然而，從體內(nèi)獲取和研究這些細(xì)胞存在諸多困難，因此建立穩(wěn)定可靠的多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞系成為當(dāng)前研究的熱點和關(guān)鍵方向。這不僅可以為深入了解 PKD 的病理生理機制提供理想的細(xì)胞模型，還能為藥物篩選和基因治療等研究開辟新的途徑。

二、材料與方法

（一）樣本來源

患者選擇

從臨床確診為多囊腎病的患者中獲取腎臟囊腫組織樣本。患者年齡在 20 - 60 歲之間，涵蓋不同疾病階段，包括早期囊腫形成和晚期腎功能受損的患者。在獲取樣本前，均獲得患者的知情同意，并經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)。

組織采集

在手術(shù)切除囊腫或囊腫穿刺活檢過程中，收集新鮮的囊腫襯里上皮組織。將組織迅速置于含有低溫保存液（如 Hank's 平衡鹽溶液與 10% 二甲基亞砜混合液）的無菌容器中，并在短時間內(nèi)轉(zhuǎn)運至實驗室進(jìn)行處理。

（二）細(xì)胞分離與培養(yǎng)

組織處理

將采集到的囊腫襯里上皮組織在無菌超凈臺中用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗，去除血液、黏液和其他雜質(zhì)。然后，使用眼科剪將組織剪成約 1 - 2mm3 的小塊。

酶消化法分離細(xì)胞

將組織小塊置于含有 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 混合消化液的離心管中，在 37℃恒溫水浴中輕輕振蕩消化。消化時間根據(jù)組織塊的大小和質(zhì)地進(jìn)行調(diào)整，一般為 20 - 30 分鐘。期間，每隔 5 - 10 分鐘取出離心管，用吸管輕輕吹打組織塊，使細(xì)胞充分解離。消化完成后，加入含有 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。

細(xì)胞培養(yǎng)

將消化后的細(xì)胞懸液通過 200 目濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片。濾液以 1000rpm 的轉(zhuǎn)速離心 5 分鐘，棄去上清液。用含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素、2mmol/L - 谷氨酰胺和多種生長因子（如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等）的特殊培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于預(yù)先用膠原蛋白 I 或纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，密切觀察細(xì)胞貼壁和生長情況，每 2 - 3 天更換一次培養(yǎng)基。

（三）細(xì)胞系的建立與鑒定

細(xì)胞傳代

當(dāng)原代細(xì)胞生長至 80% - 90% 匯合度時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用 PBS 輕輕沖洗細(xì)胞兩次，加入適量的 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 消化液，在 37℃下消化至細(xì)胞變圓、開始脫落。加入含血清培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后重懸細(xì)胞，并按照一定比例接種于新的培養(yǎng)瓶中。

細(xì)胞鑒定

形態(tài)學(xué)觀察

使用倒置相差顯微鏡定期觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，包括細(xì)胞大小、形狀、細(xì)胞核形態(tài)和細(xì)胞間連接等。多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞呈多邊形或橢圓形，細(xì)胞邊界清晰，核大而圓，可見明顯的核仁，部分細(xì)胞有雙核或多核現(xiàn)象，與體內(nèi)囊腫襯里上皮細(xì)胞的形態(tài)相似。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色

利用針對多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的抗體，如多囊蛋白 - 1（PC - 1）、多囊蛋白 - 2（PC - 2）、上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）等進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。將細(xì)胞接種于載玻片上，培養(yǎng)至適當(dāng)密度后，進(jìn)行固定、通透處理，然后依次加入一抗、二抗和顯色劑。陽性細(xì)胞呈現(xiàn)特異性的顏色反應(yīng)，通過顯微鏡觀察并統(tǒng)計陽性細(xì)胞比例，以確定細(xì)胞系的純度和特異性。

基因表達(dá)分析

提取細(xì)胞系的總 RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈反應(yīng)（RT - PCR）和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測多囊腎病相關(guān)基因（如 PKD1、PKD2 等）的表達(dá)水平。同時，檢測細(xì)胞特異性標(biāo)志物基因的表達(dá)情況，與正常腎臟上皮細(xì)胞進(jìn)行對比，進(jìn)一步驗證細(xì)胞系的來源和特性。

染色體分析

對細(xì)胞系進(jìn)行染色體核型分析，以評估細(xì)胞在長期培養(yǎng)過程中的遺傳穩(wěn)定性。采用秋水仙素處理細(xì)胞，使細(xì)胞停滯在有絲分裂中期，然后制備染色體標(biāo)本，通過 Giemsa 染色觀察染色體數(shù)目和形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

（四）細(xì)胞功能研究

細(xì)胞增殖能力測定

MTT 法

將細(xì)胞接種于 96 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為 5×103 個。培養(yǎng)一定時間后，加入 MTT 溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時。然后棄去上清液，加入 DMSO 溶解結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀在 570nm 波長處測量吸光度值。根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞生長曲線，分析細(xì)胞的增殖能力。

BrdU 摻入實驗

將細(xì)胞培養(yǎng)于含有 BrdU（5 - 溴 - 2'- 脫氧尿苷）的培養(yǎng)基中，BrdU 可在細(xì)胞增殖過程中摻入新合成的 DNA。培養(yǎng)一段時間后，固定細(xì)胞，使用抗 BrdU 抗體進(jìn)行免疫熒光染色，通過熒光顯微鏡觀察并計數(shù) BrdU 陽性細(xì)胞的比例，以評估細(xì)胞的增殖活性。

細(xì)胞分泌功能研究

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法檢測細(xì)胞分泌的與 PKD 相關(guān)的因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等的含量。同時，通過 Western blotting 分析細(xì)胞內(nèi)這些分泌蛋白的表達(dá)水平，以了解細(xì)胞的分泌功能及其調(diào)控機制。

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究

Western blotting

提取細(xì)胞總蛋白，通過 SDS - PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，然后分別用針對不同信號通路關(guān)鍵蛋白（如 Akt、ERK、mTOR 等）的抗體進(jìn)行免疫印跡分析。觀察這些蛋白的磷酸化水平和表達(dá)量變化，以了解細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活情況。

免疫共沉淀實驗

為了研究細(xì)胞內(nèi)蛋白 - 蛋白相互作用，采用免疫共沉淀實驗。將細(xì)胞裂解后，加入針對目標(biāo)蛋白（如 PC - 1 和 PC - 2）的抗體，與細(xì)胞裂解物在 4℃下孵育過夜。然后加入 Protein A/G 瓊脂糖珠，繼續(xù)孵育，離心收集瓊脂糖珠 - 抗體 - 蛋白復(fù)合物。通過 Western blotting 檢測復(fù)合物中與目標(biāo)蛋白相互作用的其他蛋白，以揭示細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子機制。

三、結(jié)果

（一）細(xì)胞系的建立

經(jīng)過多次嘗試和優(yōu)化培養(yǎng)條件，成功建立了多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞系。該細(xì)胞系在長期培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定的生長狀態(tài)，可連續(xù)傳代超過 30 次，且細(xì)胞形態(tài)和生長特性無明顯改變。

（二）細(xì)胞系的鑒定結(jié)果

形態(tài)學(xué)鑒定

細(xì)胞在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出典型的多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞形態(tài)，與體內(nèi)觀察到的細(xì)胞特征相符，證明所建立的細(xì)胞系具有較高的純度。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，細(xì)胞系中 PC - 1、PC - 2 和 EpCAM 等標(biāo)志物呈陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞比例高達(dá) 90% 以上，進(jìn)一步證實了細(xì)胞系的特異性。

基因表達(dá)分析

RT - PCR 和 qPCR 結(jié)果表明，細(xì)胞系中 PKD1、PKD2 等多囊腎病相關(guān)基因表達(dá)水平顯著高于正常腎臟上皮細(xì)胞，同時細(xì)胞特異性標(biāo)志物基因表達(dá)穩(wěn)定，從基因水平驗證了細(xì)胞系的來源。

染色體分析

染色體核型分析顯示，細(xì)胞系染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)在長期培養(yǎng)過程中保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯的染色體異常，表明細(xì)胞具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

（三）細(xì)胞功能研究結(jié)果

細(xì)胞增殖能力

MTT 法和 BrdU 摻入實驗結(jié)果均顯示，多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞系具有較強的增殖能力，明顯高于正常腎臟上皮細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線呈典型的 “S" 型，在培養(yǎng) 2 - 3 天進(jìn)入對數(shù)生長期，持續(xù)增殖至 5 - 6 天達(dá)到平臺期。

細(xì)胞分泌功能

ELISA 和 Western blotting 結(jié)果表明，細(xì)胞能夠大量分泌 VEGF、MMPs 等與囊腫形成和發(fā)展密切相關(guān)的因子。這些因子的分泌水平在不同培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，提示細(xì)胞分泌功能受到多種因素的調(diào)控。

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

Western blotting 分析顯示，細(xì)胞內(nèi) Akt、ERK、mTOR 等信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平明顯升高，表明這些信號通路在多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞中處于激活狀態(tài)。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)了 PC - 1 和 PC - 2 之間以及它們與其他信號分子之間存在復(fù)雜的相互作用，為進(jìn)一步解析 PKD 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)提供了重要線索。

四、討論

（一）細(xì)胞系建立的意義

本研究成功建立的多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞系為 PKD 的研究提供了一個理想的體外模型。與以往使用的動物模型或原代細(xì)胞培養(yǎng)相比，該細(xì)胞系具有可重復(fù)性強、細(xì)胞純度高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點。它能夠更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)囊腫襯里上皮細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)，為深入研究 PKD 的發(fā)病機制提供了有力工具。

（二）細(xì)胞特性與疾病機制的關(guān)聯(lián)

細(xì)胞增殖與囊腫形成

細(xì)胞系表現(xiàn)出的較強增殖能力與多囊腎病囊腫的不斷增大和增多密切相關(guān)。異常激活的細(xì)胞增殖信號通路可能是導(dǎo)致囊腫襯里上皮細(xì)胞過度增殖的原因，這為尋找抑制細(xì)胞增殖的治療靶點提供了依據(jù)。

細(xì)胞分泌與囊腫發(fā)展

細(xì)胞大量分泌 VEGF、MMPs 等因子，這些因子在囊腫周圍血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑等過程中發(fā)揮重要作用。通過對細(xì)胞分泌功能的研究，可以進(jìn)一步了解囊腫的發(fā)展機制，并探索通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌來控制囊腫進(jìn)展的策略。

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與疾病復(fù)雜性

細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，尤其是 PC - 1 和 PC - 2 參與的信號通路，揭示了 PKD 發(fā)病機制的復(fù)雜性。這些蛋白不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本生理功能，還通過與其他信號分子的相互作用影響整個細(xì)胞的行為，為全面解析 PKD 的分子機制提供了新的視角。

（三）研究的局限性和未來方向

局限性

盡管建立的細(xì)胞系具有諸多優(yōu)點，但仍存在一定局限性。例如，體外培養(yǎng)環(huán)境可能無法完整模擬體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，這可能會影響細(xì)胞的某些生理功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，細(xì)胞系在長期培養(yǎng)過程中可能會發(fā)生一些潛在的適應(yīng)性變化，需要進(jìn)一步監(jiān)測和評估。

未來方向

未來的研究可以進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，嘗試構(gòu)建更接近體內(nèi)環(huán)境的三維培養(yǎng)模型。同時，可以利用基因編輯技術(shù)對細(xì)胞系進(jìn)行基因修飾，研究特定基因在 PKD 發(fā)病機制中的作用。此外，基于細(xì)胞系開展大規(guī)模的藥物篩選和藥物作用機制研究，有望為多囊腎病的治療帶來新的突破。

五、結(jié)論

本研究通過創(chuàng)新的方法成功建立了多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞系，并對其進(jìn)行了全面的鑒定和功能研究。該細(xì)胞系的建立為多囊腎病的發(fā)病機制研究、治療靶點發(fā)現(xiàn)和藥物研發(fā)提供了重要的細(xì)胞模型和實驗依據(jù)。雖然目前研究還存在一定局限性，但為未來的 PKD 研究開辟了新的途徑和方向，有望推動多囊腎病治療領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。